分子标记在花卉研究中的应用进展

摘要DNA分子标记是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后发展起来的一种新型的、更为理想的遗传标记。它促进了植物遗传育种的研究，并在花卉研究中得到了广泛的应用。阐述了分子标记的主要类型、原理和特点，及其在花卉亲缘关系分析、品种鉴定与分类、遗传多样性、遗传图谱构建和辅助育种等方面的研究和应用。关键词分子标记；花朵；应用分子标记是一种新型遗传标记，不受环境条件和发育阶段等因素影响，能代表物种本身的遗传特征，已成为植物遗传育种研究的有力工具。近年来，国内外许多学者利用分子标记技术对花卉植物进行了大量的研究。 1 分子标记的分类分子标记是指与特定基因或标记连锁的扩增的、可检测的DNA序列。 DNA分子标记多以电泳带的形式表达，大致可分为两类。第一类是以分子杂交为核心的DNA分子标记，主要包括限制性片段长度多态性标记（RFLP）；第二类是以聚合酶链式反应（PCR）为核心的DNA分子标记，包括随机扩增多态性DNA标记（RAPD）、简单序列重复标记（SSR）、重复序列间长度多态性（ISSR）、扩展片段长度多态性标记1.1 RFLP标记RFLP是利用限制性内切酶对生物体基因组DNA进行切割，产生不同长度、类型和数量的限制性片段的技术。这些差异DNA片段使用克隆和标记的DNA片段作为探针进行Southern杂交，然后进行放射自显影或DNA多态性的非同位素检测。 RFLP具有技术稳定、重复性好、无表型效应、等位基因之间存在共显性、非等位基因之间无上位效应、标记数量大等优点。它是最有效的共显性DNA分子标记；但RFLP分析的探针制备、消化、膜转移、分子杂交、放射自显影等过程需要花费大量的资金和时间，而且不同的物种需要制备不同的探针。 1.2 RAPD标记RAPD标记是利用一系列单链随机引物（通常为10个碱基）对基因组DNA进行PCP扩增，检测特定DNA片段，获得多态性标记的技术。该标记技术的主要优点是速度快、成本低、引物种类不受限制、标记数量多、DNA消耗少、环境污染少等，且使用方便；缺点是该标记为显性标记，无法区分纯合和杂合基因型，稳定性差，易产生非特异性条带。 1.3 AFLP标记的基本原理是使用一种对基因组DNA限制性位点较少的酶和另一种限制性位点较多的酶的组合来消化基因组DNA，然后使用人工连接子将限制性片段的粘端连接起来以模板为模板，先进行预扩增，然后进行选择性PCR扩增，最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多态性。 AFLP标记的优点是稳定性强、重复性好、多态性高、具有显性或共显性；缺点是步骤繁琐、模板响应慢、成本高。 1.4 ISSR标记ISSR标记根据基因组中广泛存在的微卫星基因序列设计单一引物来扩增基因组DNA，扩增的指纹同时提供基因组中多个位点的序列信息。 ISSR通常是显性标记，具有良好的稳定性和多态性。与SSR相比，ISSR-PCR引物不需要事先进行DNA测序，减少了准备工作，但有些ISSR引物由于没有配对区域，可能在某些基因组DNA中没有扩增产物；与RAPD相比，ISSR揭示了更高的多态性，其准确性与RFLP相当。 1.5 SSR标记由16个核苷酸组成的短的、串联的简单重复序列(SSR)广泛存在于真核生物基因组DNA中，又称微卫星，在SSR的两端都有相对保守的单拷贝DNA，根据该序列，设计特异性双引物，通过PCR扩增重复区域，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增片段的多态性，这就是SSR标记。

由于SSR标记的多态性仅由简单序列重复次数的差异引起，因此它们通常是共显性的，并且可以鉴定纯合子和杂合子。其缺点是需要足够的人力、物力和时间来克隆足够数量的SSR，并且需要针对每一类SSR的两端序列设计特异性引物，工作量很大。 2 DNA分子标记在花卉研究中的应用及进展2.1种质资源鉴定长期以来，各种花卉异地引种栽培、杂交变异，品种名称和品种分类十分混乱。因此，对现有花卉品种进行准确鉴定和分析非常重要，分子标记技术为品种鉴定提供了新的手段。 Ballard等[1]对22个月季品种进行了RFLP和RAPD分析，鉴定出20个月季品种。结果表明，所有具有抗病和感病亲本的四倍体月季品种都表现出较高的遗传多态性，因此抗病和感病杂交后代适合建立遗传图谱。于艳丽[2]采用RAPD标记方法对金银花中的金银花及金银花品系进行鉴定，并使用35个随机引物进行扩增实验。从金银花中扩增出总共26 个DNA 带，从而区分了形态非常相似的两个菌株。明军[3]利用梅花AFLP多态性位点信息，从178个梅花品种及相关（品种）种中筛选出52个品种样本，构建梅花品种资源核心种质。 2.2 亲缘关系和分类学研究将分子标记应用于植物分类和亲缘关系分析，可以在分子水平上阐明生物系统的进化和分类，也直接关系到育种亲本的选择和种质资源的合理有效利用。 2000年，周春玲等[4]利用AFLP技术对菊花12个类群的亲缘关系进行了分析，结果表明，所选的两个品种楚菊和薄菊可以组合成一个种，与毛花菊、野生菊花有亲缘关系。菊花、洋甘菊是近亲，其次是紫色野菊花，与小红菊关系最远。王贤等[5]利用AFLP对紫薇的亲缘关系进行了研究，结果表明，矮化品种之间的亲缘关系较为密切，其中芬润和矮化垂粉的亲缘关系最为密切；性状优良的品种白蝶飞舞与层云、雪花关系较近，红蝶飞舞与蓝妖姬关系也较近，与白蜜香关系较远；紫竹银尾和白云映霞这两个常见白花品种之间的关系较为密切。张俊祥等[6]利用AFLP技术对云南省兰花14种3变种的38个样品进行了亲缘关系分析。 16对AFLP引物扩增的条带聚类结果表明，遗传多样性非常广泛，同一物种不同个体扩增的条带模式差异很大。林丽梅等[7]采用RAPD技术对百合属百合属4种商品药材进行了鉴定。刘晓丽[8]对10种报春属植物的种间变异进行了ISSR分析，并将这10种报春花分为3类。余恒秀等[9]利用ISSR引物鉴定了牡丹品种间的亲缘关系。苏雪等[10]利用RAPD技术对甘肃栽培的16个牡丹品种进行了分类初步研究。赵锡华等[11]对11种杜鹃属植物进行了RAPD分析，基于DNA分子水平探讨了杜鹃属植物之间的亲缘关系和系统发育位置。 2.3 遗传多样性研究生物多样性保护已成为国际热点问题，其核心内容是遗传多样性保护。遗传多样性主要是指一个物种内不同种群之间或同一种群不同个体之间遗传变异的总和。遗传多样性会在DNA水平上得到体现，因此近年来DNA分子标记被广泛应用于植物遗传多样性和遗传结构的研究中。史胜友等[12]利用8对引物对30个不同变异类型的花叶秋海棠进行了AFLP分析，从DNA水平发现花叶秋海棠的遗传多样性是由花叶秋海棠、陇东海带和花叶秋海棠产生的。通过渗透杂交形成。侯晓改等[13]利用荧光标记AFLP技术对30个牡丹品种基因组DNA水平进行多态性检测，共获得1 123条统计带，其中多态性965条。多态性带比例达到86%，揭示了牡丹品种丰富的遗传多样性。

田业林等[14]利用RAPD分子标记技术对8个一川红品种的DNA多态性进行了分析。 30条引物扩增出162条DNA带，其中多态性带119条，多态性占73.5%。表明RAPD技术是检测串红品种遗传多样性的有效工具，为优良品种遗传改良选择育种亲本提供依据。

1 [2] [3]